大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
 

　　本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的含量。
 

　　實(shí)驗(yàn)原理：
 

　　本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。用純化的大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)，再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)含量。
 

　　試劑盒組成：
 

　　試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
 

　　說(shuō)明書(shū) 1份 1份
 

　　封板膜 2片 2片
 

　　密封袋 1個(gè) 1個(gè)
 

　　酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
 

　　標(biāo)準(zhǔn)品 0.3ml×6管 0.3ml×6管 2-8℃保存
 

　　酶標(biāo)試劑 5 ml×1瓶 10 ml×1瓶 2-8℃保存
 

　　樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
 

　　顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
 

　　顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
 

　　終止液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
 

　　20×濃縮洗滌液 15ml×1瓶 25ml×1瓶 2-8℃保存
 

　　注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、0 ng/mL.
 

　　樣本處理及要求：
 

　　1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
 

　　2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
 

　　3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
 

　　4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
 

　　5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
 

　　6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
 

　　7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。
 

　　操作步驟
 

　　大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒1.標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；。
 

　　2.加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
 

　　3.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。
 

　　4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
 

　　5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
 

　　6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
 

　　7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
 

　　8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
 

　　9.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
 

　　注意事項(xiàng)：
 

　　1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
 

　　2.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
 

　　3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
 

　　4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值)，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
 

　　5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
 

　　6.底物請(qǐng)避光保存。
 

　　7.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
 

　　8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
 

　　9.本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
 

　　10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
 

　　計(jì)算：
 

　　以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，
 

　　在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD
 

　　值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
 

　　倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)
 

　　準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
 

　　代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋
 

　　倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
 

　　(此圖僅供參考)
 

　　大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒 試劑盒性能：
 

　　1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
 

　　2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。
 

　　檢測(cè)范圍：
 

　　3.75 ng/mL - 120 ng/mL
 

　　靈敏度：
 

　　低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL
 

　　保存條件及有效期：
 

　　1.試劑盒保存： 2-8℃。
 

　　2.有效期： 6個(gè)月