牛型放線菌PCR試劑盒說明書
 

　　產(chǎn)品名稱：牛型放線菌PCR試劑盒
 

　　產(chǎn)品規(guī)格：50T
 

　　原理是由一對引物介導(dǎo)，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進行快速酶促擴增，經(jīng)過n個熱循環(huán)擴增，擴增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0

　　特異性強
 

　　PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
 

　　①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
 

　　②堿基配對原則；
 

　　③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
 

　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。
 

　　產(chǎn)品特點：
 

　　本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品。
 

　　具有下列特點：
 

　　1.根據(jù) 指標的保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
 

　　2.靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個數(shù)量級，可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
 

　　3.即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。
 

　　4.一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
 

　　5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
 

　　6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
 

　　規(guī)格及成分                            成分
 

　　2×qPCR MagicMix                 500 μL(裝 A 袋)
 

　　微量核酸稀釋液(熒光 PCR )1 mL(裝 A 袋)
 

　　PCR 引物混合物                        100 μL(裝 A 袋)
 

　　基因陽性對照                           50 μL(裝 B 袋)
 

　　DNA 病毒裂解液(試用裝)       15 次(9 mL)
 

　　使用手冊                              1 份
 

　　運輸及保存：低溫運輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準備區(qū)、B 袋的陽性對照分開放置)，
 

　　自備試劑DNA 模板、10×ROX(根據(jù)機型決定，具體見使用方法)。
 

　　應(yīng)用案例
 

　　樣品 DNA 的制備
 

　　1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
 

　　稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對照。
 

　　2.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
 

　　3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭，下同)。
 

　　4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
 

　　6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
 

　　7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
 

　　牛型放線菌PCR試劑盒設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20  μL 體系，在樣品制備室進行)
 

　　9.在 PCR 管中加入下列成分(待測樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加)：
 

　　注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX，則用水替代。
 

　　10. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR(具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行
 

　　優(yōu)化)。
 

　　過程溫度時間
 

　　預(yù)變性95℃1 分鐘
 

　　PCR 反應(yīng)95℃15 秒
 

　　(30 個循環(huán))60℃15 秒
 

　　72℃15 秒
 

　　11. 數(shù)據(jù)采集
 

　　具體操作按所用儀器*的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時，
 

　　大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光
 

　　譜在 530 nm。
 

　　四、數(shù)據(jù)處理
 

　　12. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品
 

　　的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
 

　　組成及試劑配制:
 

　　1、酶標板：一塊(96孔)
 

　　2、 標準品(凍干品)： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀釋)，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
 

　　3、 樣品稀釋液：1×20ml。
 

　　4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
 

　　5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
 

　　注意事項：
 

　　1.基礎(chǔ)程序；
 

　　2.擴增溫度和延伸溫度；
 

　　3.反應(yīng)時間；
 

　　4.循環(huán)次數(shù)；
 

　　5.PCR 反應(yīng)液的配制；
 

　　6.PCR技術(shù)的基本原理；
 

　　7.PCR的反應(yīng)動力學(xué)；
 

　　8.PCR擴增產(chǎn)物；
 

　　9.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
 

　　【儲存條件及有效期】:
 

　　-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。
 

　　【適用儀器】:
 

　　ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。
 

　　【樣本采集、存放及運輸】
 

　　u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；
 

　　u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(多凍融3次)；
 

　　u 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
 

　　【自備試劑】:產(chǎn)品僅用于科研實驗