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上海一研生物科技有限公司
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禽白血病病毒I亞群RT-PCR試劑盒

時間:2020-10-7閱讀:367
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  禽白血病病毒亞群PCR定量試劑盒說明書
 
  產(chǎn)品名稱:禽白血病病毒亞群PCR定量試劑盒
 
  英文名稱:Avian Leukosis Virus(ALV)
 
  產(chǎn)品規(guī)格:50次
 
  運輸:低溫
 
  保存:負20度
 
  有效期:一年
 
  貨期:現(xiàn)貨
 
  禽白血病病毒I亞群RT-PCR試劑盒產(chǎn)品及特點:
 
  因此快速靈敏檢測禽白血病病毒I亞群RT-具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,它具有下列特點:
 
  1. 即開即用,用戶只需要 DNA 模板。
 
  2. 引物經(jīng)過精心優(yōu)化,專一性強,只擴增禽白血病病毒I亞群RT-,與其他植物沒有交叉反應。
 
  3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
 
  4. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
 
  5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次,但只能用于科研。
 
  PCR實驗方法步驟:
 
  方法
 
  1:在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
 
  10×PCR buffer
 
  5 μl     dNTP mix(2mM)
 
  4 μl     引物1(10pM)
 
  2 μl     引物2(10pM)
 
  2 μl     Taq酶(2U/μl)
 
  1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)
 
  1 μl     加ddH2O至50 μl
 
  視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
 
  2:調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃40s → 58℃30s → 72℃60s,循環(huán)30-35次,在72℃保7min。
 
  3:結束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃*保存。
 
  4:PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl氯仿進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
 
  禽白血病病毒I亞群RT-PCR試劑盒產(chǎn)品僅用于科研14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
 
  1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
 
  2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
 
  3. 細胞上清液:廠家3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
 
  4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
 
  5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
 
  需要自備的器材:
 
  1.產(chǎn)品僅用于科研儀器:分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器(2 µL、20
 
  µL、200 µL、1000 µL)。
 
  2.耗材:熒光 PCR 反應管、眼科剪、*、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水
 
  處理的滅菌離心管、吸頭(10 µL、200 µL、1000 µL)、滅菌雙蒸水。
 
  特點:
 
  1.廠家即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板,操作簡單,定量準確快速。
 
  2. 引物經(jīng)過優(yōu)化,特異性強。預期的 PCR 產(chǎn)物長度為 560 bp。
 
  3. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
 
  4. 提供陽性對照,便于分析試驗結果。操作流程:
 
  1.整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
 
  2.為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。
 
  3.每次實驗應該設置陰、陽性對照。
 
  4.試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。
 
  5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū),并單獨存放。
 
  6.為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
 
  7.儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。
 
  8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
 
  9.實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
 
  儲存條件:
 
  14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
 
  1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
 
  2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
 
  3.細胞上清液:3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
 
  4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
 
  5.保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
 
  禽白血病病毒I亞群RT-PCR試劑盒反應五要素:
 
  參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
 
  引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
 
 ?、僖镩L度: 15-30bp,常用為20bp左右。
 
 ?、谝飻U增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
 
 ?、垡飰A基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
 ?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
 
  ⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
 
 ?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點, 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
 
 ?、咭锏奶禺愋裕阂飸c核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
 
  引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
 
  運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存,保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置,不要污染其他試劑。
 
  自備試劑:樣品 DNA。

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