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　　前言： 多肽藥物是介于大分子蛋白/抗體類(lèi)藥物和小分子藥物之間的一 類(lèi)重要的藥物分子，因其生物活性高、靶向?qū)Ｒ恍愿摺⑦x擇性 高、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于疾病治療領(lǐng)域[1]。Thermo Obitrap因其超高的分辨率，質(zhì)量軸穩(wěn)定性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用 在了多肽藥物結(jié)構(gòu)表征中。Obitrap 作為高分辯還具有*靈敏 度和線(xiàn)性范圍，因此也被越來(lái)越多的應(yīng)用到藥物的定量研究中 [2,3]。
 

　　PTH 是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的由84個(gè)氨基酸組成的多肽類(lèi) 激素，其對(duì)于維持鈣磷代謝的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。 特立帕肽(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，4117.7 Da)是一種人工重組合成的人PTH 1-34多 肽，是第yi個(gè)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的抗骨質(zhì)疏松性骨折的骨合成藥物 [3]。 Thermo Scientific Q Exactive Focus 四極桿 Orbitrap 組合型質(zhì) 譜儀專(zhuān)為常規(guī)分析應(yīng)用而設(shè)計(jì)，高分辨率為7萬(wàn)，大分辨 率12Hz，可以在同一系統(tǒng)中同時(shí)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確可靠的定性和定量分 析。 Obitrap Fusion Lumos是賽默飛世爾科技在2015年推出的三合 一的靜電場(chǎng)軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀。Lumos搭載的分段式四級(jí) 桿技術(shù)(Advanced Quadrupole Technology，AQT)使離子傳 輸效率至少提高了 2 倍，超高場(chǎng)的Obitrap擁有50萬(wàn)分辨率和 20Hz的超快掃描速度，使Lumos在具有高靈敏度同時(shí)，還 擁有穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)范圍。 本實(shí)驗(yàn)將基于兩款Obitrap高分辯質(zhì)譜Q Exactive Focus和Obitrap Fusion Lumos建立多肽藥物特立帕肽的定量分析方法，考 察高分辯質(zhì)譜Obitrap的定量能力。
 

　　實(shí)驗(yàn)條件 樣品配置： 稱(chēng)取特立帕肽粉末，加水稀釋成5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。用 含5%乙腈，0.1μg/μL BSA，1%甲酸的稀釋劑，逐級(jí)稀釋特立 帕肽標(biāo)準(zhǔn)品，配置成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 色譜條件： 液相系統(tǒng)為：Thermo Vanquish Flex液相色譜儀，色譜柱為T(mén)hermo AccucoreTM 150 C18(50×2.1mm，2.6um，貨號(hào)16126-052130) ；柱溫：45℃；流動(dòng)相及梯度系統(tǒng)程序見(jiàn)表1
 

　　血漿樣品前處理： 取150μL的人空白血漿，加入15μL的特立帕肽工作液，震蕩混 勻。按體積比1:6加入含75%乙腈，0.1% FA的沉淀劑后，充 分震蕩。6500g離心5min，取上清后，40℃揮干。揮干樣品 用150μL含10% ACN，90%水，1% FA的復(fù)溶劑復(fù)溶，充分震 蕩，14000g離心5min，取上清，上樣5μL進(jìn)行分析。 數(shù)據(jù)分析： 所有數(shù)據(jù)分析均使用Thermo Scientific™ TraceFinder™ 軟件完 成。TraceFinder平臺(tái)包含了儀器控制，方法開(kāi)發(fā)，數(shù)據(jù)定性定 量批處理等功能。提峰時(shí)質(zhì)量偏差為±5ppm。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、特立帕肽標(biāo)準(zhǔn)品在Focus，Lumos上的線(xiàn)性與準(zhǔn)確度。 用稀釋劑(含0.1ug/μL BSA，1% FA，5% ACN)的稀釋劑逐級(jí) 稀釋特立帕肽標(biāo)準(zhǔn)品，配置成一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，上樣分析。 結(jié)果表明，F(xiàn)ocus對(duì)特立帕肽的定量下限為50 pg/mL(圖1)， 上樣5μL，上柱約60 amol，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好，R2=0.997，標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)各點(diǎn)回算的濃度在理論值的15%以?xún)?nèi)(表4)。
 

　　特立帕肽的LOQ點(diǎn)在Focus和Lumos上的提峰圖如圖3，峰型良 好，信噪比S/N>10，重復(fù)5針的RSD<10%(表6)，表現(xiàn)出了 良好的穩(wěn)定性。
 

　　2、特立帕肽血漿樣品在Lumos上的線(xiàn)性與準(zhǔn)確度。 同時(shí)在Lumos上考察了特例帕肽血漿樣品的定量下限。取150 μL的空白人血漿，加入一系列濃度梯度的特立帕肽標(biāo)準(zhǔn)品，配 置成血漿標(biāo)曲，用1:6體積的75% 乙腈沉淀后，離心去上清， 揮干，復(fù)溶后進(jìn)樣。 結(jié)果顯示，Lumos對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的血漿樣品仍表現(xiàn)出良好的線(xiàn) 性，精密度，穩(wěn)定性。特立帕肽低定量下限為50 pg/mL，線(xiàn) 性范圍50 pg/mL-50 ng/mL(圖4)，1000倍的線(xiàn)性范圍，上柱 量約60 amol，標(biāo)曲各點(diǎn)Diff值 < 10%(表7)。
 

　　結(jié)論： 本文分別在Obitrap Focus賽默飛四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀，Lumos上建立了大分子多肽類(lèi)藥物 特例帕肽的定量分析方法。結(jié)果表明，高分辯Obitrap對(duì)特立 帕肽表現(xiàn)出良好的定量能力，定量下限可以分別達(dá)到上柱60 amol，24 amol。同時(shí)，對(duì)于基質(zhì)更為復(fù)雜的血漿樣品，Lumos 上可以達(dá)到定量下限上柱60 amol，靈敏度滿(mǎn)足臨床上對(duì)特立帕 肽的檢測(cè)要求。Obitrap作為高分辨質(zhì)譜，在擁有超高分辨率的 同時(shí)，兼具出色的靈敏度和穩(wěn)定性，可以應(yīng)用大分子多肽類(lèi)藥 物的定量分析與檢測(cè)。
 

　　參考文獻(xiàn) [1] Lau J L, Dunn M K. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions[J]. Bioorganic & medicinal chemistry, 2018, 26(10): 2700-2707. [2] Dillen L, Cuyckens F. High-resolution MS: first choice for peptide quantification?[J]. Bioanalysis, 2013, 5(10): 1145-1148. [3] Kang L, Weng N, Jian W. LC–MS bioanalysis of intact proteins and peptides[J]. Biomedical Chromatography, 2019: e4633. [4] Quattrocchi E, Kourlas H. Teriparatide: a review[J]. Clinical therapeutics, 2004, 26(6): 841-854.