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　　智立中特(武漢)生物科技有限公司主要致力于質粒微生物資源的保護、共享和持續(xù)利用，圍繞我國生命科學研究、生物技術創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展等重大需求，探索、發(fā)現(xiàn)、收集國內(nèi)外的微生物資源，妥善長期保存管理;在保證生物安全和保護知識產(chǎn)權的前提下，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護、科研教育提供質粒載體物物種資源、基因資源、信息資源和專業(yè)技術服務。旗下質粒載體網(wǎng)是一款提供質粒載體展示及定制的專業(yè)型網(wǎng)站，由智立中特(武漢)生物科技有限公司聯(lián)合多家企業(yè)公司科研院校共同打造!主要展示了各種基因類型下的質粒載體!

　　1. Freestyle™ 293-F細胞的培養(yǎng)：在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng);轉染當天Freestyle™ 293-F細胞密度達到1.5-2.5×106個/ml時可以進行轉染，但細胞存活率需>95%;可以使用生產(chǎn)的臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒(C0011)進行細胞存活率檢測。

　　2. 以50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細胞為例，取兩個潔凈無菌離心管，分別加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F細胞培養(yǎng)液;然后其中一管加入50μg質粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™轉染試劑，分別用移液器輕輕吹打混勻，請?zhí)貏e注意不可Vortex或離心。將含有DNA的培養(yǎng)液用槍輕輕加入含Lipo293F™轉染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15分鐘(室溫存放6小時內(nèi)穩(wěn)定)。

　　3. 把2.5ml Lipo293F™轉染試劑-DNA混合物全部加入到50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細胞中。由于青mei素/鏈mei素雙抗可能影響重組蛋白的表達，通常不建議在細胞轉染時加入雙抗;如細胞培養(yǎng)環(huán)境容易發(fā)生污染，可酌情加入1/5常規(guī)用量的雙抗。

　　4. Freestyle™ 293-F細胞在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后，即可收集細胞進行目的蛋白的檢測和純化。

　　常見問題：

　　1. 轉染效率低：

　　a. 優(yōu)化質粒與Lipo293F™轉染試劑比例，有必要是可以適當嘗試加大質粒用量。

　　b. 應使用高純度、無菌、無污染物的質粒進行轉染，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范圍內(nèi)，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染?？梢允褂蒙a(chǎn)的質粒大量抽提試劑盒(D0026)進行抽提，以保證可以獲得較高的轉染效率。

　　c. 需用無抗生素和無血清培養(yǎng)液配制Lipo293F™轉染試劑和質粒的混合物。

　　d. 轉染后培養(yǎng)時間不足，而被誤認為轉染效率偏低。懸浮狀態(tài)下的Freestyle™ 293-F細胞轉染后至顯著表達所需培養(yǎng)時間通常為48-72小時。

　　e. 檢查細胞是否有支原體感染，支原體感染會影響細胞增殖，并很可能影響轉染效率。

　　f. 如果沒有檢測到目的蛋白表達，應該仔細核對轉染質粒的測序結果，確保測序結果和讀碼框wan全正確。

　　g. 檢查轉染時細胞密度是否過高。

　　2. 細胞毒性較明顯：

　　a. 目的基因的表達蛋白有毒性。此時可以和空載體轉染效果比較，以確定是否是目的基因蛋白表達對細胞產(chǎn)生毒性。如果確定有細胞毒性，可以考慮適當減少質粒用量，并按照比例減少Lipo293F™轉染試劑。

　　b. 檢查轉染時細胞密度是否太低。

　　c. 檢查細胞是否有支原體等微生物污染。