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Gaud Pinel1 ，Sandrine Roulet-Rochereau1 ，Marie-Hélène Le Breton1,2 ， 
Sylvain Chéreau1 ，F(xiàn)abrice Monteau1 ，Paul Silcock3，與Bruno Le Bizec1 
1Laboratoire d’ Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA)，ONIRIS，Nantes，F(xiàn)rance 法國(guó)LABERCA 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 
2瑞士洛桑雀巢公司，雀巢研究中心 
3 英國(guó)曼徹斯特沃特世公司 

應(yīng)用優(yōu)勢(shì) 
牛注射了重組牛生長(zhǎng)激素，過幾天后檢測(cè)藥物在牛體內(nèi)的殘留。得到了明確的檢測(cè)結(jié)果，可用于此類藥物的使用監(jiān)控。 
■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測(cè)生物基質(zhì)中的重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ），符合2002/657/EC 要求。 
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測(cè)動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物。 
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來說是十分重要的。 

沃特世解決方案 
■ ACQUITY UPLC，Xevo TQ MS 
關(guān)鍵詞 
■ rbST，reST ，生長(zhǎng)激素，食品安全 

簡(jiǎn)介 
動(dòng)物性食品安全控制是政府、法規(guī)機(jī)構(gòu)與組織的重要任務(wù)，應(yīng)該在食品進(jìn)入消費(fèi)環(huán)節(jié)之前就對(duì)食品安全進(jìn)行有效的檢測(cè)和控制。因?yàn)樯鲜泻蟮氖称钒踩录赡苡绊懴M(fèi)者信心與貿(mào)易。 
重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ），又稱為生長(zhǎng)激素，在一些國(guó)家通常作為豬或牛的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，將其用于乳?？梢栽黾优Ｄ坍a(chǎn)量1,2 。然而，生長(zhǎng)激素的使用有嚴(yán)格的法律規(guī)范，在歐盟國(guó)家是*禁用的3,4 。但是，這項(xiàng)法規(guī)的執(zhí)行面臨著很大的困難，主要是因?yàn)槿狈τ行У姆治龉ぞ邅頇z測(cè)是否存在濫用該激素的情況。此分析的困難在于生長(zhǎng)激素本身是蛋白質(zhì)，且在生物基質(zhì)中濃度較低，而樣品基質(zhì)組成又十分復(fù)雜。至今為止，分析方法僅僅局限為酶聯(lián)免疫檢測(cè)，這個(gè)方法不能將天然存在的激素與重組激素分離開來；盡管也有其它應(yīng)用報(bào)導(dǎo)，但都不能專屬性很強(qiáng)地檢測(cè)生理水平的重組牛生長(zhǎng)激素（rbST）5,6 。 
直到zui近才開發(fā)出了一項(xiàng)直接檢測(cè)生物基質(zhì)中重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ）的方法7,8 ，這個(gè)方法是將重組生長(zhǎng)激素用*進(jìn)行水解，然后分析生長(zhǎng)激素專有的N-端肽鏈。事實(shí)上，天然激素的N-端氨基酸是*，而重組激素的N-端氨基酸是*。 
此應(yīng)用文章展示了使用Waters® XevoTM TQ MS 分析注射了重組激素的動(dòng)物血漿樣品中的藥物。在注射后幾天進(jìn)行檢測(cè)，可清晰檢測(cè)出結(jié)果，展示了*水平。 

實(shí)驗(yàn)部分 
重組激素標(biāo)準(zhǔn)品 
重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ）標(biāo)準(zhǔn)品與重組馬生長(zhǎng)激素（reST ）分別購(gòu)自哈勃UCLA 醫(yī)學(xué)中心國(guó)家激素與垂體項(xiàng)目（美國(guó)托蘭斯）以及Bresagen 有限公司（澳大利亞T hebarton ）。 

樣本制備 
重組牛生長(zhǎng)激素在血漿中的樣本提取、純化步驟依照文獻(xiàn)進(jìn)行。7,8 

MS條件 
MS系統(tǒng)：XEVO TQ MS 
離子化模式：ESI+ 
毛細(xì)管電壓：3 kV 
源溫度：150℃ 
脫溶劑溫度：550℃ 
脫溶劑氣速：800 L/小時(shí) 
碰撞氣流速：0.15 mL/分 

MRM方法參數(shù) 
MRM通道通過Masslynx軟件中的InliStartTM行獨(dú)立的參數(shù)優(yōu)化，詳見表2。 

結(jié)果與討論 
LC/MS/MS條件優(yōu)化 
ACQUITY UPLC系統(tǒng)對(duì)*水解的N-端肽片段又很好的保留和分離效果，總運(yùn)行時(shí)間8分鐘，重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ）與重組馬生長(zhǎng)激素（reST ）的N-端保留時(shí)間分別為2.74和2.79分鐘（圖1）。 
重組牛生長(zhǎng)激素（rbST）N-端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生雙電荷的離子[M+2H]2+=913 ，將此離子作為母離子。根據(jù)2002/657/EC歐盟委員會(huì)決議10 ，MRM方法中選擇了兩個(gè)子離子用于確證；重組馬生長(zhǎng)激素（reST ）作內(nèi)標(biāo)物，在樣品中的濃度為100 ng/mL ，其N-端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生三價(jià)電荷的離子[M+3H]3+= 623 ，將其作為母離子。 

動(dòng)物注射生長(zhǎng)激素后體內(nèi)rbST的檢測(cè) 
此方法用于檢測(cè)注射生長(zhǎng)激素后的動(dòng)物樣品。對(duì)奶牛一次性皮下注射500mg Lactatropin®藥物，然后取樣分析。 

圖1 對(duì)10 ng/mL的rbST和reST標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，UPLC(ESI+)/MS/MS 的MRM特征離子信號(hào)分別為rbST 的N-端碎片離子為913>774和913>1047；reST的N-端碎片離子為623 >795和623 >530 



圖2 使用UPLC（ESI+）/MS/MS分析注射藥物前（D0）與注射后兩天（D2）采集到的血漿樣本的的MRM特征離子信號(hào)圖譜 

圖2顯示了注射藥物前采集到的血漿樣本得到的譜圖（D0）以及注射藥物兩天后血漿樣本的譜圖（D2）。
圖2的結(jié)果表明：可以在給動(dòng)物注射生長(zhǎng)激素兩天后在奶牛的血漿中檢測(cè)到rbST 。對(duì)采集到的特征信號(hào)分析表明此方法可以對(duì)生長(zhǎng)激素這個(gè)蛋白進(jìn)行明確的確證，符合2002/657/EC 的要求，同時(shí)確認(rèn)了檢測(cè)方法的靈敏度。 
與預(yù)計(jì)的動(dòng)物血漿蛋白水平一致?；|(zhì)干擾幾乎檢測(cè)不到，在實(shí)際血漿樣本中的良好線性可保證對(duì)rbST 的進(jìn)一步相對(duì)定量結(jié)果，在注射生長(zhǎng)激素兩天后還可以檢測(cè)到血漿中50 ppb 的藥物，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致7,11 。表3顯示了平行進(jìn)樣10 次得到的分析結(jié)果，這充分說明Xevo TQ MS 在檢測(cè)低含量復(fù)雜樣品時(shí)能夠提供重復(fù)性好的數(shù)據(jù)。 

結(jié)論 
■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測(cè)生物基質(zhì)中的重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ），符合2002/657/EC 要求
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測(cè)動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物 
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來說是十分重要的 

參考文獻(xiàn) 
[1] Burton JL, McBride BW, Block E, Glimm DR and Kennelly JJ. A review of bovine growth hormone. Canadian Journal of Animal Science. 1994; 74: 167-201. 
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from a treated goat. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 2008; 22: 3130-3136. 
[8] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Pinel G, Cesbron N and Le Bizec B. Elimination kinetic of recombinant somatotropin in bovine. Analytica Chimica Acta. 2009; 637: 121-127. 
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[10] Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities. 2002, 2002/657/EC. 
[11] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Chereau S, Pinel G, Delatour T and Le Bizec. Identification of cows treated with recombinant bovine somatotropine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, DOI:10.1021/jf903032q.