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分光光度計(jì)，又稱(chēng)光譜儀(spectrometer)，是將成分復(fù)雜的光，分解為光譜線的科學(xué)儀器。測(cè)量范圍一般包括波長(zhǎng)范圍為380~780 nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200~380 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的380~780nm波長(zhǎng)的光譜光通過(guò)三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源。
光度定義
分光光度法是在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。常用的波長(zhǎng)范圍為:(1)200~380nm的紫外光區(qū)，(2)380~780nm的可見(jiàn)光區(qū)，(3)2.5~25μm(按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見(jiàn)光分光光度計(jì)(或比色計(jì))、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。
原理
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光線透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光線被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長(zhǎng)度)成正比，其關(guān)系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度;
I。為入射的單色光強(qiáng)度;
I 為透射的單色光強(qiáng)度;
T 為物質(zhì)的透射率;
k 為摩爾吸收系數(shù);
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng);
c 為物質(zhì)的濃度;
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱(chēng)比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。
維護(hù)保養(yǎng)
分光光度計(jì)作為一種儀器，在運(yùn)行工作過(guò)程中由于工作環(huán)境，操作方法等種種原因，其狀況必然會(huì)發(fā)生某些變化，可能影響設(shè)備的性能，甚至誘發(fā)設(shè)備故障及事故。因此，分析工作者了解分光光度計(jì)的基本原理和使用說(shuō)明，并能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和排除這些隱患，對(duì)已產(chǎn)生的故障及時(shí)維修才能保證儀器設(shè)備的正常運(yùn)行。
1)若大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新校正"0"和""點(diǎn)。然后再測(cè)量。
2)指針式儀器在未接通電源時(shí)，電表的指針位于零刻度上。若不是這種情況，需進(jìn)行機(jī)械調(diào)零。
3)比色皿使用完畢后，請(qǐng)立即用蒸餾水沖洗干凈，并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。
4)操作人員不應(yīng)輕易動(dòng)燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。
5)分光光度計(jì)，由于其光電接收裝置為光電倍增管，它本身的特點(diǎn)是放大倍數(shù)大，因而可以用于檢測(cè)微弱光電信號(hào)，而不能用來(lái)檢測(cè)強(qiáng)光。否則容易產(chǎn)生信號(hào)漂移，靈敏度下降。針對(duì)其上述特點(diǎn)，在維修、使用此類(lèi)儀器時(shí)應(yīng)注意不讓光電倍增管長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下，因此在預(yù)熱時(shí)，應(yīng)打開(kāi)比色皿蓋或使用擋光桿，避免長(zhǎng)時(shí)間照射使其性能漂移而導(dǎo)致工作不穩(wěn)。
6)放大器靈敏度換擋后，重新調(diào)零。
7)比色杯的配套性問(wèn)題。比色杯配套使用，否則將使測(cè)試結(jié)果失去意義。在進(jìn)行每次測(cè)試前均應(yīng)進(jìn)行比較。具體方法如下;分別向被測(cè)的兩只杯子里注入同樣的溶液，把儀器置于某一波長(zhǎng)處，石英比色杯;220nm、700nm裝蒸餾水，玻璃比色杯:700nm處裝蒸餾水，將某一個(gè)池的透射比值調(diào)至，測(cè)量其他各池的透射比值，記錄其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范圍內(nèi)則可以配套使用，若超出此范圍應(yīng)考慮其對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。
分光光度計(jì)分操作中容易出現(xiàn)的幾個(gè)典型故障及其排除方法:
1)儀器不能調(diào)零?？赡茉?
a)光門(mén)不能關(guān)閉。解決方法:修復(fù)光門(mén)部件，使其關(guān)閉。
b)透過(guò)率""旋到底了。解決方法:重新調(diào)整""旋鈕。
c)儀器嚴(yán)重受潮。解決方法:可打開(kāi)光電管暗盒，用電吹風(fēng)吹上一會(huì)兒使其干燥，并更換干燥劑。
d)電路故障。解決方法:送修理，檢修電路。
2)儀器不能調(diào)""?？赡茉?
a)光能量不夠。解決方法:增加靈敏度倍率檔位，或更換光源燈(盡管燈還亮)。
b)比色皿架未落位。解決方法:調(diào)整比色皿架使其落位。
c)光電轉(zhuǎn)換部分老化。解決方法:更換部件。
d)電路故障。解決方法:調(diào)修電路。
3) 測(cè)量過(guò)程中,""點(diǎn)經(jīng)常變動(dòng)?？赡茉?
a)比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解決方法:用擦鏡紙擦干凈比色皿表面，然后將其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位。
b)電路故障(電壓、光電接收、放大電路)。解決方法:送修。
4)數(shù)顯不穩(wěn)?？赡茉?
a)預(yù)熱時(shí)間不夠。解決方法:延長(zhǎng)預(yù)熱時(shí)間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因，長(zhǎng)時(shí)間處于工作狀態(tài)時(shí)，也會(huì)工作不穩(wěn))。
b)光電管內(nèi)的干燥劑失效，使微電流放大器受潮。解決方法:烘烤電路，并更換或烘烤干燥劑。
c)環(huán)境振動(dòng)過(guò)大、光源附近空氣流速大、外界強(qiáng)光照射等。解決方法:改善工作環(huán)境。
d)光電管、電路等其它原因。解決方法:送修。
五、提高分光光度計(jì)透射比檢定及使用精度的幾種方法
在分光光度計(jì)的使用或檢定中,透射比(吸光度)的準(zhǔn)確度是衡量?jī)x器工作性能的一項(xiàng)重要指標(biāo),它的準(zhǔn)確程度直接關(guān)系到所測(cè)數(shù)據(jù)的可信性及科學(xué)性。所以提高此項(xiàng)指標(biāo)的使用及檢定準(zhǔn)確度顯得尤為重要。
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